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TLR7基因多态性与尖锐湿疣易感性及复发的相关性调查

   尖锐湿疣是由人乳头瘤病毒(HPV)感染所致的性传播疾病,CA在西方国家已成为最常见的性传播疾病之一,在我国发病率也显着升高。目前已有200多型的HPV,并且不断有新的HPV型别被发现。HPV感染存在地区及人种的差异,其原因尚不清楚。

 

  Toll样受体家族具有模式识别受体的功能,可以识别微生物的保守分子成分,启动机体的固有免疫系统而清除病原体。研究发现TLR7基因多态性与多种细菌和病毒的易感性相关,与尖锐湿疣易感性的研究尚未见报道。本课题组对140例尖锐湿疣患者外周血中TLR7基因多态性进行了研究,现将结果报道如下。

 

  1 对象与方法

 

  1.1 对象

 

  140例尖锐湿疣患者选自2011年8月至2012年6月在杭州市第三人民医院性病门诊就诊的患者,均为浙江汉族人,其中男性78例,女性62例,年龄18~67岁,平均年龄(36.8±15.3)岁,均符合卫生部《性病诊疗规范和推荐方案》中的尖锐湿疣的诊断标准,疣体大小及数目类似,除外梅毒、HIV、乙肝病毒及HSV2感染,并除外合并自身免疫性疾病及恶性肿瘤。

 

  同时选择105例性病门诊与尖锐湿疣患者有过无保护性性接触史,9个月内无尖锐湿疣临床表现且HPV检测阴性的浙江汉族患者,同时除外梅毒、HIV、乙肝病毒及HSV2感染合并自身免疫性疾病及恶性肿瘤者做为对照,对照组中男性54例,女性51例,年龄为(35.7±14.7)岁。患者及对照组均抽取外周静脉血5ml,EDTA抗凝后-80℃保存备用。同时所有尖锐湿疣患者均采用液氮冷冻治疗,局部外用康复新液及干扰素凝胶,不采用系统药物治疗,统计患者治疗后6个月内有无复发,治疗6个月内无复发临床疗效好,有复发为临床疗效差。

 

  1.2 方法

 

  1.2.1 试剂

 

  Taq酶、DNTP及ExoI是购自Fermentas公司,Snapshot试剂盒购自ABI公司,PCR仪型号为:东胜·龙(EDC-810),测序仪型号为ABI 3730XL。TLR7的rs179008(32A>T)引物序列为:上游5′-GCAAAAGAGAGGCAG-CAAATG-3′,下游5′-CACGATCACATGGT-TCTTTGG-3′,rs2302267(120T>G)引物序列为:上游5′-GGAATATGTCTCCAGTCTACC-3′,下游5′-TGGAATGTAGAGGTCTGGTTG-3′,rs864058(2403TG>A)引物序列为:上游5′-CCCAGAAATAGAGGTGACTTG-3′,下游5′-TGATGCTGTGTGGTGTCTG-3′,由上海捷瑞生物有限公司合成。

 

  1.2.2 试验方法

 

  常规提取人全血DNA,测定浓度后调整DNA浓度相等,取1μl模板DNA进行多重PCR反应,PCR反应体系为DNA 1μl,10×buffer 1.5μl,25mmol/L MgCl21.5μl,10mmol/L DNTP 0.3μl,引物混合0.15μl,5U/μlTaq酶0.3μl,加去离子水补至15μl。

 

  PCR反应条件为95℃/3min,94℃/15s,60℃/15s,-0.5℃/Cycles 11循环后改为72℃/30s,94℃15s,54℃/15s进行24循环后72℃延伸3min,PCR产物纯化后取2μl,Snapshot Mix试剂1μl,延伸引物混合2μl,加去离子水补至6μl,反应条件为96℃/1min,96℃/10s,52℃/5s,60℃/30s,共30循环,反应结束后取1μl延伸产物,加10μl上样缓冲液,95℃变性3min,立即冰水浴,上测序仪。

 

  1.3 统计学处理

 

  计算尖锐湿疣患者及对照组的TLR7 rs179008,rs2302267及rs864058的基因型及基因频率,并计算治疗后复发及无复发尖锐湿疣患者的上述基因位点的基因型及基因频率,采用SPSS 14.5软件进行基因频率的χ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

 

  2 结 果

 

  2.1 TLR7 rs179008和rs864058基因多态性在在尖锐湿疣组及对照组中的分布情况 TLR7rs179008和rs864058在对照组中均为野生型,未检出突变,在治疗后复发的尖锐湿疣患者中各有1例杂合突变,其中rs179008突变为AT,rs864058突变为GA,提示rs179008及rs864058在浙江汉族中突变极为罕见。

 

  2.2 TLR7  rs2302267基因多态性在在尖锐湿疣组及对照组中的分布情况

 

  TLR7rs2302267在尖锐湿疣组及对照组中均有野生型、杂合型及纯合子突变,与对照组相比,尖锐湿疣组突变基因G的频率显着升高,差异有统计学意义,见表1。

 

表1   尖锐湿疣患者及对照组中TLR7  rs2302267基因型及基因频率的分布

尖锐湿疣患者及对照组中TLR7  rs2302267基因型及基因频率的分布

 

  2.3 TLR7  rs2302267基因多态性在治疗6个月内无复发及复发尖锐湿疣患者中的分布情况

 

  140例尖锐湿疣患者治疗后6个月内无复发者有87例,复发的患者有53例,治疗6个月内复发率为37.86%。其中复发者尖锐湿疣组TLR7 rs2302267的突变基因G频率显着升高,差异有统计学意义,见表2。

 

表2  尖锐湿疣治疗复发组及无复发组rs2302267基因型及基因频率的分布

尖锐湿疣治疗复发组及无复发组rs2302267基因型及基因频率的分布

 

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