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辽宁省人群尿道下裂DGKK基因多态性的研究方法

    2012年8月至2013年12月,收集300例在沈阳华大医院泌尿外科手术治疗的尿道下裂患者(年龄0.5~26岁)的静脉血,其中200例中远端型,100例近端型,以手术中确定的尿道开口进行分组,开口于阴茎头、冠状沟、阴茎干及阴茎根为中远端型组,开口于阴茎阴囊、阴囊及会阴为近端型组。利用静脉血提取DNA进行测序。利用非整倍体筛查保证所有病例染色体均为46,XY,排除嵌合子等异常核型。2012年7月至2013年6月,门诊收集200例(年龄4~30岁)包皮环切患者的外周血(术中均确定正常尿道开口),提取DNA进行测序对照。本研究获得沈阳华大医院伦理委员会审核通过及患者知情同意。

 

  方法

 

  主要试剂与仪器

 

  血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、PC扩增试剂盒(天根公司);PC自动扩增仪(PerkinElmer,美国)、DNA测序仪(ABI,美国)。

 

  基因组DNA提取

 

  按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书抽取外周血基因组DNA,方法为离心柱法。

 

  PC反应和产物处理

 

  提取外周血白细胞基因组DNA后,利用Pubmed数据库下载rs1934179和rs7063116的标准序列。将每个外显子向两端延伸100~150bp,转换成纯文本文件,输入到引物设计软件Premier5.0中进行引物设计(表1)。以25μl反应体系,向离心管中依次加入:10×缓冲液2.5μl,dNTP4μl,Taq酶0.25μl,上、下游引物各1μl,cDNA1μl,加水至25μl。PC反应条件:95℃3min;95℃解链30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,共40个循环;72℃延伸7min;4℃保存。取3μlPC产物行1%琼脂糖凝胶电泳,应用Tanon3500成像系统紫外成像,紫外灯下观察结果。凝胶扫描分析仪行密度扫描,计算特异性扩增目的条带OD值,以DL2000为DNAMarker,计算其相对OD值,利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司)进行纯化。

 

  DNA测序

 

  使用美国ABIPISM3700DNA自动测序仪,利用双脱氧末端终止法进行PC产物的序列分析。测序结果应用Phred/Phrap软件分析,找出突变位点,对发现的突变位点,重复上述过程以验证结果的可靠性和可重复性。

 

  统计学分析

 

  利用SPSS.13.0软件进行统计学分析,率的比较用χ2检验,结果以P≤0.05认为有统计学意义。

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